ELISA試劑盒（一） PCR的基本原理 PCR擴(kuò)增放大DNA的基本原理和基本過程如下：將含有所需放大分析序列的DNA加熱變性為單鏈，然后加入一對與所放大分析的DNA兩端鄰近序列互補(bǔ)的寡聚核苷酸片段作為引物，即左端引物和右端引物。這對引物必須將所需放大分析的DNA片段包括在其范圍內(nèi)。引物可根據(jù)已知DNA序列用DNA自動合成儀合成，一般只需20個(gè)堿基對，但不能更少，否則在68℃就不能保持與DNA單鏈的互補(bǔ)結(jié)合，在有DNA多聚酶和4種三磷酸脫氧核苷（dATP、dTTP、dCTP、dGTP或dNTP）存在下，以放大分析的DNA單鏈為模板，按5′到3′方向?qū)⒁镅娱L，自動合成新的DNA鏈，使DNA重新變成雙鏈。因此，在反應(yīng)中左、右引物不僅起指導(dǎo)作用，而且起到特異性限制放大合成DNA片段范圍大小的作用。將合成的DNA雙鏈再次加熱變性，繼續(xù)重復(fù)以上的DNA多聚酶反應(yīng)，左、右引物之間這段DNA的量就可成指數(shù)倍數(shù)增加。如重復(fù)進(jìn)行這一反應(yīng)n次，則從理論上講，PCR放大的DNA倍數(shù)就為2n倍，這樣DNA的量就可在數(shù)小時(shí)內(nèi)特異地獲得幾十萬倍的放大。T4DNA多聚酶和大腸桿菌DNA多聚酶I的klenow片段都可用于PCR，但比較試驗(yàn)的結(jié)果顯示T4放大產(chǎn)生的DNA與模板一致，而用klenow片段放大的產(chǎn)物內(nèi)除含有與模板一致的DNA外，還混有非特異的低分子片段，因而T4比klenow更適用于PCR。1988年Erlich等從耐高溫的水生嗜熱菌（Thermus aquaticus）中提取了一種簡稱為Taq的耐高溫DNA多聚酶。由于Taq多聚酶幾乎不受加熱變性的影響，因而用這種酶進(jìn)行PCR省去了每次加熱變性后重新加入DNA多聚酶的步驟，使重復(fù)反應(yīng)能連續(xù)進(jìn)行。

（二） PCR的特點(diǎn)
1．敏感 由于PCR能將一段DNA分子特異地放大約100萬倍，因而極為敏感。PCR可用于檢測DNA含量極微的標(biāo)本（1ng DNA），甚至可將單根頭發(fā)絲中所含的單一分子DNA放大后進(jìn)行檢測。
2. 特異 PCR不僅敏感，而且特異。據(jù)報(bào)道，將PCR放大后的DNA克隆作序列分析，結(jié)果表明，PCR放大的DNA序列與原模板DNA序列一致。
3. 簡易快速 PCR可用于直接檢測粗制的DNA標(biāo)本，如細(xì)胞裂解液、血細(xì)胞DNA提取液，省去了對標(biāo)本中檢測DNA的精制純化過程。PCR在一天內(nèi)即能完成，如尚需作電泳分析、雜交或序列分析等，一般也可在1～3天內(nèi)完成。
4. 可檢測固定包埋的病理標(biāo)本或部分DNA降解標(biāo)本 因?yàn)镻CR并不要求所放大的DNA為完整的大分子，所以PCR的另一特點(diǎn)是可用于檢測已用福馬林固定或石蠟包埋過的病理組織標(biāo)本或只有5μm薄的切片，也能用于檢測已部分降解的DNA標(biāo)本。
5. 直接作序列分析 PCR可提供足夠量的特異DNA作序列分析，省去了以往必須克隆后再作序列分析的過程。在PCR引物上事先用32P作末端標(biāo)記，放大后的DNA可直接作Maxam-Gilbert序列分析，或用雙脫氧核苷酸終端法作序列分析。
6．可放大RNA PCR也能對RNA或cDNA進(jìn)行放大，有些外顯子散在分布在一段很長的DNA中，因而難以將整段DNA大分子放大和作序列分析，但如用mRNA作為模板，就可將外顯子集中，一次就能用PCR完成對外顯子的放大和序列分析。
7．無放射性 PCR放大作用本身具有特異性，因而放大后只要用電泳測定到相應(yīng)量和大小的DNA片段，就能證明標(biāo)本中存在所檢測的DNA序列。由于PCR放大的DNA量足以使肉眼就能對電泳后經(jīng)溴化乙錠染色的DNA條帶進(jìn)行觀察或攝影，因而PCR可作為一種不用同位素的非放射檢測方法，易于在臨床檢測中推廣。

需要指出的是，上述的PCR對DNA病毒的診斷顯示了很高的敏感性，操作亦很簡單，易于應(yīng)用。但對RNA病毒的診斷，就比較復(fù)雜，在進(jìn)行PCR之前，首先應(yīng)進(jìn)行RNA的分離，隨后作反轉(zhuǎn)錄，即在反轉(zhuǎn)錄體系中加入一條與mRNA多聚A互補(bǔ)的多聚T作引物，反轉(zhuǎn)錄與mRNA互補(bǔ)的cDNA鏈，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的檢測物，此即為檢測RNA病毒用的RT-PCR。

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