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聯(lián)系我們ELISA 檢測常用樣本處理方法
點擊次數(shù)：1379 更新時間：2021-09-15
ELISA是一種快速、靈敏、準確可靠的定量分析方法。樣本的處理對于 Elisa 實驗的成功有舉足輕重的作用。
利用 ELISA 進行檢測的樣本類型包括：血液(血清、血漿)，組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養(yǎng)上清，皮膚組織、尿液、糞便、肺泡灌洗液、唾液、腦脊液、胸腹水、前列腺液、陰道分泌物等。
下面我們就常用的樣本處理方法：
血液樣本
血液采取后應盡快進行處理，使血清(漿)從與血細胞接觸的全血中分離出來。
Q: 血清與血漿的區(qū)別?
A: 血清是血液凝固后缺少纖維蛋原的血漿，故血漿中除尚含有纖維蛋白原和 抗凝劑外，其他成份均等同于血清。
Q: 選擇血清還是血漿樣本？
A: 由于血清中缺乏很多的凝血因子，但有凝血產物。如果測凝血因子建議選擇血漿樣本；同時血漿中有纖維蛋白原，如果纖維蛋白原對待檢測指標有影響，建議選擇血清樣本。
大多數(shù)情況下二者均可以選擇。
處理方法：
血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置 2 小時或 4 度過夜，然后1000×g 離心20分鐘，取上清即可。這是一個讓血液自然凝固的過程，溫度越低，凝集越緩慢，可根據(jù)需要添加促凝劑。
血漿：血漿樣本需要抗凝，一般建議用2.0%EDTA，1%肝素，3.8%枸櫞酸鈉作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2~8度1000g離心15分鐘，取上清即可檢測。根據(jù)待檢測目標物的性質不同選取不同的抗凝劑。
枸櫞酸鈉(檸檬酸鈉)：Ca2+有凝血作用，枸櫞酸鈉能與血液中的鈣離子形成可溶性的螯合物，從而阻止血液凝固。配成 109mmol/L的濃度和血液1:9, 106mmol/L的濃度和血液1:4
缺點：血液中溶解度低，抗凝作用較弱。
優(yōu)點：對凝血因子有很好的保護作用，大部分凝血試驗都可用枸櫞酸鈉抗凝。
二胺四乙酸(EDTA)鹽：與血液中的鈣離子結合形成配位化合物， 從而阻止血液凝固。15g/L EDTA和血液 1:10
優(yōu)點：對紅細胞和白細胞形態(tài)影響小。
缺點：影響血小板的聚集。不適用于凝血實驗和血小板功能相關實驗的檢 測。
肝素：通過與抗凝血酶Ⅲ結合，增強抗凝血酶的作用，滅活絲氨酸蛋白 酶，從而可阻止凝血酶的形成和阻止血小板聚集，阻止血液凝固。肝素鈉 1g/L 與血液 1:10
優(yōu)點：抗凝能力強、不影響血細胞體積、不易溶血、能耐高溫。
缺點：引起白細胞聚集。肝素抗凝血應于短時間內使用，否則放置過久血 液又可凝固。
組織樣本(組織樣本一般是制成組織勻漿)
處理方法：
1)取適量組織塊，于預冷 PBS(0.02mol/L, pH 7.0-7.2)中清洗去除血液， 稱重后備用(組織塊較大需先剪碎后再勻漿)；
2)可同時選用多種勻漿方法達到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃 勻漿器，加入 5-10ml 預冷 PBS(組織與 PBS 的質量體積比建議為 1:5，即 1g 樣 本加入 5ml PBS)進行充分研磨(有條件實驗室可選用機器勻漿)，該過程需在冰 上進行；得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復凍融進一步處理(超聲破碎過 程中注意冰浴降溫；反復凍融法可重復 2 次)。
3)將制備好的勻漿液于 5000×g 離心 5 分鐘，留取上清即可檢測。
4)如果樣本需要長期保存，請?zhí)砑拥鞍酌敢种苿?。根?jù)實驗需要，組織勻 漿樣本可先定量總蛋白,以便于統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。某些組織樣本如肝臟，腎臟，腦 組織會有假陽性反應。
細胞樣本
根據(jù)目的物所在部位，可選擇細胞裂解液或細胞培養(yǎng)上清作為樣本。需要注意的是：
因該類樣本干擾因素較多，所以可能存在檢測不出的情況。
如果目的物是分泌型，主要在胞外，即可選擇細胞培養(yǎng)上清作為樣本；
如果目的物主要存在于胞內，則建議選擇細胞裂解液作為樣本類型。
處理方法：
細胞培養(yǎng)上清：處理方法相對簡單，取細胞培養(yǎng)上清，1000×g 離心 20 分 鐘，取上清即可檢測。
細胞裂解液：
1)貼壁細胞需要先用胰酶消化，離心收集細胞(懸浮細胞可直接離心收 集)
2)將收集到的細胞用冷 PBS 洗 3 次
3)物理方法裂解細胞(可先超聲破碎細胞，再反復凍融)：
i 超聲破碎：取適量 PBS 重懸細胞，用一定功率的超聲波處理細胞 懸液，使細胞急劇震蕩破裂；
ii 反復凍融：將待破碎的細胞在-20 度以下冰凍，室溫融解，反復 3 次，使細胞溶脹破碎；
4)將標本于 2-8 度 1500×g 離心 10 分鐘，收集上清備用。
一般情況下，物理方法如反復凍融，勻漿等方法會比化學方法好，因為化 學方法會引入酸或堿，可能會對 elisa 實驗產生影響。我們也做了相關實驗來評 測化學提取液和洗滌劑對 ELISA 檢測的影響，如 RIPA、TritonX-100、NP-40 和 SDS、脫氧膽酸鈉、β巰基乙醇、DTT。
痰液
1)選擇痰液中較為粘稠部分稱重，加兩倍于痰量的 0.1% DTT(二硫蘇糖醇)， DTT 的主要作用是溶解粘液，用吸管反復吹打，漩渦器振蕩 15s，37 度恒溫水浴振蕩 5 分鐘；
2)加入兩倍于痰量的 PBS 緩沖液繼續(xù)振蕩 15-20 分鐘，150 目的金屬絲網(wǎng)過濾，1500 rpm 離心 10 分鐘吸取上清液檢測。
糞便
盡量采集干的糞便，糞便過稀會較難處理且降低檢測的準確性。采集的重量應大于50mg，將糞便用PBS洗3次(最終糞便質量：PBS 體積=1:9)，用超聲粉碎(或搗碎)后于5000×g離心10分鐘，取上清檢測。
唾液
將樣品收集于離心管后在-70 度冰凍 1 小時。在冰上融化樣品后，2000×g 離 心 10 分鐘，取上清檢測。
皮膚組織
用勻漿機加冰的 PBS 研磨 20-50 mg 的皮膚組織使其充分溶解，離心 20 分 鐘，10000 g/分鐘，取上清檢測。
牛乳
于4度，12000g/分鐘離心30分鐘，去除上層脂肪，以及下層沉淀，取中間層樣本用于檢測。
腦脊液、肺泡灌洗液
樣本收集后于1000×g 離心20分鐘，離心后收集上清，并將標本保存于-20度，且應避免反復凍融。
處理樣本的過程就是收集目標蛋白的過程，由于蛋白容易變性，降解，故 該過程應盡量溫和。樣本處理之后的儲存也非常重要，尤其注意不要反復凍融， 樣本處理之后可分裝密封保存，4 度保存應小于1周，-20 度不應超過1個月，-80 度不應超過2個月。
在標本使用前應緩慢均衡至室溫，不應加熱使之融解。樣本的處理是實驗成功的第一步，以上就是關于Elisa特殊樣本處。
