PCR 反應(yīng)特異性提高的方法：

1. 引物的設(shè)計

引物最好在模板 cDNA 的保守區(qū)設(shè)計，長度 15-30bp，GC 含量小于 60%，3’端不超過連續(xù)三個 G 或 C，堿基分

布錯落有致，避免引物自身形成二聚體，設(shè)計完成之后，需進(jìn)行 BLAST 檢測，如果與其他基因不具有互補(bǔ)性，則可以進(jìn)行下一步實驗。

2. 降落 PCR

降落 PCR 是一種簡單的降低非特異性產(chǎn)物的 PCR，最大的優(yōu)點就是可以降低實驗耗時，同時又可以優(yōu)化實驗的步驟。引物的設(shè)計決定退火溫度，退火溫度過高會使 PCR 效率過低，過低則會使非特異擴(kuò)增過多。這雖然可以通過反復(fù)嘗試來優(yōu)化，但費時費力。降落 PCR 提供了一個較為簡易的優(yōu)化方法。首先在較高的溫度下擴(kuò)增，此時雖然擴(kuò)增效率低，但非特異擴(kuò)增基本沒有。隨著退火溫度的降低，非特異擴(kuò)增會逐步增多。但由于此時特異的擴(kuò)增產(chǎn)物已經(jīng)達(dá)到一定的數(shù)量優(yōu)勢，因此會對非特異擴(kuò)增產(chǎn)生強(qiáng)烈的競爭抑制，從而大幅提高 PCR 的特異性和效率。

3. 熱啟動擴(kuò)增

采用熱啟動方法進(jìn)行擴(kuò)增，是除了設(shè)計最佳引物之外，提高 PCR 反應(yīng)特異性的方式。在一般的 PCR 反應(yīng)中，試劑的配置需在冰上進(jìn)行，且要將 PCR 儀預(yù)熱，這種方法就類似于熱啟動，能夠一定程度的抑制錯配。但是酶在低溫下也存在活性，只要體系中有 DNA 鏈存在，就會擴(kuò)增產(chǎn)生非特異性條帶。采用熱啟動的方法就是在達(dá)到變性溫度之前wan全抑制酶的活性，而zui 效的方法就是使用熱啟動 Taq 酶（或熱啟動高保真聚合酶）去擴(kuò)增，它的原理就是采用化學(xué)修飾的方法封閉酶的活性中心，當(dāng)溫度上升到 95℃時恢復(fù)活性，指導(dǎo)擴(kuò)增。

4. 巢式 PCR

采用巢式 PCR 進(jìn)行擴(kuò)增，在多輪擴(kuò)增結(jié)果中提高擴(kuò)增特異性和靈敏度。與普通 PCR 不同的是，它采用兩對引物進(jìn)行擴(kuò)增，首先用第一對引物普通 PCR，然后將第一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物稀釋 100 倍后用第二對引物（巢式引物）二次擴(kuò)增。因此采用巢式 PCR 可以大大增加困難模板擴(kuò)增的特異性和有限靶序列的靈敏度。