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PCR反應(yīng)溫度循環(huán)參數(shù)詳解
點擊次數(shù):1117 更新時間:2023-11-13

PCR反應(yīng)溫度循環(huán)參數(shù)詳解:

  1.變性溫度與時間

  PCR反應(yīng)中模板DNA的變性十分重要。只有的模板DNA和PCR產(chǎn)物雙鏈解開,才能有效的和引物結(jié)合。這種結(jié)合是PCR擴增的基礎(chǔ)。變性溫度越高,時間越長變性就越充分。但溫度過高、時間過長又會影響Taq DNA聚合酶的活性,所以通常選用變性溫度為95℃30s為宜。在PCR反應(yīng)中第一個循環(huán)變性最重要,需時間較長,因模板DNA的鏈比較長。

  2.復(fù)性溫度與時間

  變性溫度是PCR反應(yīng)成敗的關(guān)鍵,復(fù)性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復(fù)性越好,但是容易出現(xiàn)引物與靶DNA的錯配,增加非特異性結(jié)合,溫度太高不利于復(fù)性,大多數(shù)PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度在55℃左右。確定了復(fù)性溫度后,復(fù)性時間并不是關(guān)鍵因素。但復(fù)性時間太長會增加非特異的復(fù)性。

  3.延伸溫度與時間

  引物延伸溫度一般為72℃。這個溫度即考慮了Taq DNA聚合酶的活性,又考慮到引物和靶基因的結(jié)合。不合適的延伸溫度不僅會影響擴增產(chǎn)物的特異性,也會影響其產(chǎn)量,72℃時,核苷酸的合成速度為35-100個核苷酸/S,這取決于緩沖體系、pH、鹽濃度和DNA模板的性質(zhì)。72℃延伸1min對于長達2kb的擴增片段是足夠的。然而,延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對很低濃度底物的擴增,延伸時間要長些。

  4.循環(huán)數(shù):

  循環(huán)數(shù)決定著擴增的產(chǎn)量。在其它參數(shù)都已優(yōu)化條件下,最適循環(huán)數(shù)取決于靶序列初始濃度。靶序列的初始濃度較低時、要增加循環(huán)次數(shù)。另外,酶活性不好,或量不足時也要增加循環(huán)次數(shù)、以便達到有效的擴增量。


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