WHO對(duì)HIV診斷試劑的評(píng)價(jià)
　 1998年，為向其成員國(guó)提供HIV實(shí)驗(yàn)室診斷方面的建議，世界衛(wèi)生組織AIDS規(guī)劃署(GPA)啟動(dòng)了評(píng)價(jià)商品化HIV抗體診斷試劑的計(jì)劃，目前也涵蓋了對(duì)抗原試劑及抗原／抗體試劑的評(píng)價(jià)。該計(jì)劃對(duì)一系列商業(yè)化診斷試劑的評(píng)價(jià)結(jié)果，為衛(wèi)生部門負(fù)責(zé)人有針對(duì)性地選擇診斷試劑提供了參考，同時(shí)也為診斷試劑的評(píng)價(jià)提供了標(biāo)準(zhǔn)。截至目前，所評(píng)價(jià)的試劑包括血清／血漿抗體檢測(cè)試劑、快速檢測(cè)(S／R)試劑、全血快速檢測(cè)試劑、尿液／唾液檢測(cè)試劑及抗原／抗體檢測(cè)試劑。自1998年GPA啟動(dòng)商品化HIV診斷試劑評(píng)價(jià)計(jì)劃至今，已發(fā)布6份評(píng)價(jià)報(bào)告，評(píng)價(jià)的商業(yè)化試劑有63種之多，其中包括ELISA試劑、S／R試劑和WB試劑，檢測(cè)的樣本包括血清、血漿、全血、唾液和尿液等。

一、所評(píng)價(jià)的試劑以及所用的樣品

評(píng)價(jià)報(bào)告中所使用的試劑均為目前廣為應(yīng)用的商品化試劑，由商無(wú)償提供。不同的診斷試劑檢測(cè)樣本不同，針對(duì)診斷試劑檢測(cè)樣本的要求選擇相應(yīng)的評(píng)價(jià)樣品，主要包括血清／血漿樣本、全血樣本、唾液樣本和尿液樣本。

1．血清／血漿樣品的選擇

WHO評(píng)價(jià)過(guò)的檢測(cè)血清／血漿樣本的試劑有ELISA抗體試劑、S/R試劑和ELISA抗原／抗體試劑，不同原理的試劑在樣本選擇方面略有不同。

ELISA抗體試劑和S／R試劑在樣本選擇上基本相同，所用樣品主要由三部分組成：WHO血清盤、陽(yáng)轉(zhuǎn)系列血清盤和HIV-1 O型血清，其中，HIV-1 O型血清不是必須選擇的。以WHO于1998對(duì)人類血清HIV抗體檢測(cè)試劑評(píng)價(jià)為例，ELISA抗體試劑和S／R試劑所用的樣品*相同。WHO血清盤包括595份血清樣品，分別來(lái)自不同地區(qū)，包含不同亞型，其陽(yáng)性與陰性樣品比例約為1：2，具體如表17．4所示。8個(gè)陽(yáng)轉(zhuǎn)系列血清盤購(gòu)自美國(guó)BBI(Boston Biomedica Inc)公司，其編號(hào)分別為PRB 904、PRB909、PRB 911、PRB 912、PRB914、PRB 916、PRB 917和PRB 918，為8個(gè)不同患者不同時(shí)期的系列陽(yáng)轉(zhuǎn)血清。6份HIV-l O型血清經(jīng)線性免疫分析試驗(yàn)進(jìn)行確證，并用HIV-1 O型及M型特異性引物進(jìn)一步確認(rèn)。WHO血清盤及陽(yáng)轉(zhuǎn)系列血清盤應(yīng)用于所有評(píng)價(jià)試劑，而HIV-1 0型血清僅用于評(píng)價(jià)能檢測(cè)HIV-1 O型的試劑盒。

ELISA抗原／抗體試劑的樣品選擇與上述兩者略有差別，在WH0血清盤及陽(yáng)轉(zhuǎn)系列血清盤的選擇原則上，三者無(wú)明顯區(qū)別，除上述兩種評(píng)價(jià)樣品外，抗原／抗體試劑評(píng)價(jià)樣品還有操作血清盤，以2004年wHO對(duì)抗原／抗體試劑的評(píng)價(jià)報(bào)告為例，操作血清盤購(gòu)自：BBI，包括一套由不同滴度抗HIV-1抗體血清組成的抗體血清盤和一套由不同滴度p24抗原血清組成的抗原血清盤，前者包括25份血清，后者包括19份血清，血清WB及抗原檢測(cè)結(jié)果由BBI提供。

2．全血樣品的選擇

全血試劑評(píng)價(jià)樣品包括三部分：WHO全血血樣品盤、其對(duì)應(yīng)的血清盤和BBI陽(yáng)轉(zhuǎn)系列血清盤。以WHO 2000年對(duì)全血診斷試劑的評(píng)價(jià)為例，250份全血樣品收集于ED-TA抗凝管中，同時(shí)收集了與其對(duì)應(yīng)的血清樣品，250份樣品中，170份為抗HIV-1陰性，80份為陽(yáng)性。8個(gè)陽(yáng)轉(zhuǎn)系列血清盤購(gòu)自美國(guó)BBI公司。

3．尿液及唾液樣品的選擇

尿液及唾液樣品包括兩部分：WH0尿液或唾液樣品盤及其對(duì)應(yīng)的血清樣品。因唾液及尿液試劑不能檢測(cè)血清樣品，因此選擇的樣品不包括BBI陽(yáng)轉(zhuǎn)系列血清盤。以WHO 2002年對(duì)尿液及唾液診斷試劑評(píng)價(jià)為例，介紹樣品選擇及預(yù)處理。

1)尿液樣品：WHO共收集了300份尿液樣品及其對(duì)應(yīng)的血清樣品，其中，93份為HIV陽(yáng)性，207份為HIV陰性。先將新鮮的尿液收集至無(wú)菌容器中，然后無(wú)菌分裝至聚丙烯螺口管中，不添加防腐劑，于2～8℃保存。所有樣品檢測(cè)前200g離心1min，然后轉(zhuǎn)移至無(wú)菌管中。所有血清樣品于一30℃凍存，凍融1或2次。

2)唾液樣品：WH0共收集了222份唾液樣品及其對(duì)應(yīng)的血清樣品，其中，75份為HIV陽(yáng)性，147份為HIV陰性。根據(jù)不同唾液診斷試劑的要求對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。血清樣品保存方式與尿液對(duì)應(yīng)血清樣品相同。

二、實(shí)驗(yàn)室操作以及參比試劑的選擇

所有檢測(cè)均嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書操作，通常評(píng)價(jià)一類試劑的所有實(shí)驗(yàn)由一人操作完成，除WB以外的其他試劑，對(duì)一份樣品若*次檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則對(duì)該樣品重復(fù)檢測(cè)一次，若兩次結(jié)果不一致，再重復(fù)一次實(shí)驗(yàn)，以三次檢測(cè)中兩次相同的結(jié)果作為該樣品檢測(cè)結(jié)果，若三次檢測(cè)結(jié)果各不相同，則將結(jié)果記為不確定。由于陽(yáng)轉(zhuǎn)系列血清價(jià)格昂貴，對(duì)陽(yáng)轉(zhuǎn)系列血清的檢測(cè)只進(jìn)行一次。對(duì)ELISA檢測(cè)結(jié)果將根據(jù)試劑要求用酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)。S／R及WB試劑檢測(cè)分別由三人獨(dú)立地判定結(jié)果，以結(jié)果相同的兩次作為zui終結(jié)果，若三人判定結(jié)果都不相同，則將結(jié)果記為不確定。

在待評(píng)價(jià)試劑檢測(cè)前，先用參比試劑對(duì)評(píng)價(jià)用樣品進(jìn)行檢測(cè)。在所有WHO HIV診斷試劑評(píng)價(jià)報(bào)告中，所用的參比試劑均為血清／血漿的檢測(cè)試劑。在血清／血漿樣品診斷試劑的評(píng)價(jià)中，參比試劑的檢測(cè)樣品與待評(píng)價(jià)試劑的相同；而在其他類型樣品(全血、尿液、唾液等)的診斷試劑評(píng)價(jià)中，參比試劑的檢測(cè)樣品為其他類型樣品所對(duì)應(yīng)的血清／血漿樣品。

參比試劑包括兩種類型：初篩試劑和確證試劑。初篩試劑一般為ELISA診斷試劑，至少應(yīng)包括兩種試劑(有時(shí)用確證試劑替代，如對(duì)HIV-2陽(yáng)性樣品的檢測(cè))；確證試劑一般為WB試劑和(或)LIA試劑，對(duì)于HIV-1陽(yáng)性樣品一般只需一種確證試劑，而對(duì)于HIV-2陽(yáng)性樣品則需三種確證試劑，來(lái)區(qū)分單純HIV-2感染和與HIV-1共感染。

以S／R診斷試劑評(píng)價(jià)為例。S／R試劑檢測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的血清／血漿中，所有HIV陰性及HIV-1陽(yáng)性樣品先經(jīng)兩種ELISA診斷試劑篩查，兩種診斷試劑為VironostikaHIV Uni-Form II plus O(Organon Teknika)和the Enzygnost Anti-HIV 1／2 Plus(Be-hringwerke AG)，兩種試劑檢測(cè)均為陰性，則認(rèn)為其為陰性，若任一試劑檢測(cè)為陽(yáng)性，則用相同試劑雙份復(fù)試，若任一試劑或兩試劑重復(fù)仍為陽(yáng)性，則用免疫印跡試驗(yàn)進(jìn)行確證，確證試劑為InnoLIA HIV(Innlgenetics)。對(duì)于HIV-2陽(yáng)性樣品，為了區(qū)分單純HIV-2感染和與HIV-1共感染，先用兩種wB試劑對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，兩種試劑為West-ern Blot HIV-1(WB HIV-1)[GenelabsDiagnostics，HIV Blot，(version 1．2)]和NEWLAV BLOT II(WB HIV-2)(SanofiDiagnostics Pasteur)，若兩種檢測(cè)試劑均為陽(yáng)性或結(jié)果不確定，則再用Pepti-Lav 1+2(Sanofi Diagnostics Pasteur)進(jìn)行確證。若WB結(jié)果中出現(xiàn)兩條env條帶，無(wú)論有無(wú)gag、pol條帶，結(jié)果都為陽(yáng)性；若WB結(jié)果中無(wú)任何條帶為陰性；其他檢測(cè)結(jié)果為不確定。參比試劑檢測(cè)不確定的樣品，在試劑評(píng)價(jià)中不予應(yīng)用。

三、評(píng)價(jià)的技術(shù)指標(biāo)

WHO HIV體外診斷試劑的評(píng)價(jià)指標(biāo)有靈敏度、特異性、陽(yáng)性預(yù)期值、陰性預(yù)期值、可信限、δ值、重復(fù)性，前文已做了詳細(xì)介紹，不再贅述，僅就其特殊的評(píng)價(jià)指標(biāo)做簡(jiǎn)要介紹，包括陽(yáng)轉(zhuǎn)系列血清相對(duì)敏感性系數(shù)、操作血清檢測(cè)靈敏度、結(jié)果判定變異度。

1．陽(yáng)轉(zhuǎn)系列血清相對(duì)敏感性系數(shù)

除尿液及唾液檢測(cè)試劑外，其他試劑都對(duì)BBI陽(yáng)轉(zhuǎn)系列血清進(jìn)行了檢測(cè)，以參比試劑對(duì)陽(yáng)轉(zhuǎn)系列血清檢測(cè)結(jié)果作為對(duì)照，WH0選擇Enzygnost Anti-HIV 1／2 Plus(Behringwerke AG)作為參比試劑，對(duì)每一陽(yáng)轉(zhuǎn)血清盤，Enzygnost Anti-HIV 1／2 Plus檢出的*份系列血清定為0，將待評(píng)價(jià)試劑檢測(cè)結(jié)果與其作對(duì)比，確定待評(píng)價(jià)試劑檢出的*份系列血清與參比試劑的0血清的位置關(guān)系。對(duì)任一陽(yáng)轉(zhuǎn)血清盤而言，若待評(píng)價(jià)試劑檢測(cè)出*份為陽(yáng)性的樣品的位置在參比試劑的O血清位置前2位，則該待評(píng)價(jià)試劑檢測(cè)該轉(zhuǎn)血清盤的相對(duì)敏感性系數(shù)為一2。反之，若在參比試劑的0血清位置后3位，則相對(duì)敏感性性系為+3。如此類推，對(duì)全部陽(yáng)轉(zhuǎn)血清盤而言，待評(píng)價(jià)試劑的陽(yáng)轉(zhuǎn)血清相對(duì)敏感性系數(shù)為所有單獨(dú)的相對(duì)敏感性系數(shù)的均值，并計(jì)算95％可信限，以此來(lái)評(píng)價(jià)試劑對(duì)窗口期樣品的檢測(cè)能力，數(shù)值越小，試劑越靈敏。

2．操作血清檢測(cè)靈敏度

為評(píng)價(jià)HIV Ag／Ab試劑對(duì)不同滴度抗原及抗體血清的檢測(cè)能力，在HIV Ag／Ab試劑評(píng)價(jià)中引入了操作血清盤檢測(cè)。操作血清盤有兩種：抗體操作血清盤和抗原操作血清盤，分別由不同滴度抗體和p24抗原的血清組成。用待評(píng)價(jià)Ag／Ab試劑分別檢測(cè)抗體及抗原操作血清盤，檢測(cè)結(jié)果與。BBI提供的抗體wB及抗原試劑檢測(cè)結(jié)果做比較，得出待評(píng)價(jià)試劑檢測(cè)操作血清盤的靈敏度。

3．結(jié)果判定變異度

當(dāng)試劑檢測(cè)結(jié)果不是由儀器而是由操作者人為讀取時(shí)，不同操作者讀取的結(jié)果可能存在差異。如WB及S／R試劑檢測(cè)結(jié)果的讀取，此情況下，結(jié)果的讀取通常由三人獨(dú)立完成，zui終結(jié)果為兩人判斷相同的結(jié)果，若三人結(jié)果都不同，則結(jié)果為不確定。結(jié)果判定變異度為結(jié)果判定不一致的血清占總血清數(shù)的百分比：結(jié)果判定變異度=結(jié)果判斷不一致血清/總血清數(shù)100％

4．附加分析

除上述評(píng)價(jià)指標(biāo)外，WHO還制定了一套評(píng)分系統(tǒng)，由實(shí)驗(yàn)操作者對(duì)試劑滿意度、試劑的操作簡(jiǎn)便性、應(yīng)用于小實(shí)驗(yàn)室的可行性等進(jìn)行評(píng)估。

四、WHO評(píng)價(jià)試劑的具體內(nèi)容

WHO對(duì)HIV診斷試劑的評(píng)價(jià)結(jié)果以圖表的形式列出，主要包括以下幾方面的內(nèi)容：①試劑的一般特性；②待評(píng)價(jià)試劑與參比試劑結(jié)果比較；③操作方面的特點(diǎn)；④試劑應(yīng)用的簡(jiǎn)便性及應(yīng)用于小實(shí)驗(yàn)室的可行性；⑤陽(yáng)轉(zhuǎn)系列血清檢測(cè)結(jié)果比較；⑥操作血清盤檢測(cè)結(jié)果比較(HIV Ag／Ab試劑)。

1．試劑的一般特性

試劑的一般特性包括以下幾個(gè)方面：①試劑商及產(chǎn)地；②試劑類型，按試劑原理分類，如雙抗原夾心ELISA、免疫層析試劑；③試劑、原料，如包被抗原或抗體類型，是重組抗原還是合成抗原，是HIV哪一段的抗原，是單克隆抗體還是多克隆抗體，針對(duì)HIV哪一段抗原的抗體；④固相支持物的類型，如ELISA 試劑一般為12×8的微孔板條；⑤檢測(cè)樣本的類型為血清／血漿、全血、尿液或唾液等；⑥每個(gè)試劑盒所包含的反應(yīng)數(shù)；⑦批號(hào)及失效日期；⑧儲(chǔ)存時(shí)間及條件；⑨每一反應(yīng)所需樣本量；⑩檢測(cè)一次所需時(shí)間及處理的樣品量；⑨結(jié)果讀取方式，如wB試劑為肉眼讀取，ELISA為分光光度計(jì)讀取并注明波長(zhǎng)；⑥每人份的市場(chǎng)指導(dǎo)價(jià)。

2．待評(píng)價(jià)試劑與參比試劑結(jié)果比較

即以參比試劑檢測(cè)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)價(jià)待評(píng)價(jià)試劑，其評(píng)價(jià)指標(biāo)包括以下幾方面：①靈敏度及靈敏度95％可信限；②特異性及特異性95％可信限；③不確定結(jié)果百分率；④結(jié)果判定變異度；⑤陽(yáng)性預(yù)期值；⑥陰性預(yù)期值。

3．試劑盒操作方面的特點(diǎn)

主要包括以下幾方面：①試劑盒的大小(寬-長(zhǎng)-高)；②儲(chǔ)存條件；③反應(yīng)條件；④反應(yīng)終止后的穩(wěn)定性；⑤試劑盒中各組分開(kāi)封后的穩(wěn)定性及儲(chǔ)存條件，如ELISA試劑盒中的微孔板條、陰陽(yáng)性對(duì)照、樣品稀釋液、酶結(jié)合物等；⑥每次實(shí)驗(yàn)每一試劑盒所能檢測(cè)的zui大和zui小樣品數(shù)；⑦每次檢測(cè)中所需的對(duì)照及其數(shù)量；⑧每次檢測(cè)所需時(shí)間；⑨試劑盒未提供但檢測(cè)所需的儀器設(shè)備；⑩結(jié)果判斷法則，包括cut-off值計(jì)算公式；⑥灰區(qū)或無(wú)效結(jié)果的判定。

4．操作者對(duì)試劑盒的總體評(píng)價(jià)

WHO制定了一套評(píng)分系統(tǒng)，由實(shí)驗(yàn)操作人員對(duì)試劑盒做出總體評(píng)價(jià)，主要包括以下幾方面：①試劑盒操作步驟，1～2步為6分，3～5步為3分，>5步為1分；②試劑盒說(shuō)明書情況，“好”為2分，“需改進(jìn)”為1分；③試劑盒及其組分的包裝及標(biāo)簽，“好”為2分，“需改進(jìn)”為1分；④總分，上述三項(xiàng)分?jǐn)?shù)之和；⑤操作者對(duì)試劑盒的建議。評(píng)分越高，操作者對(duì)試劑盒的評(píng)價(jià)越高。

5．操作簡(jiǎn)便性分析  

WHO對(duì)試劑盒操作的簡(jiǎn)便性分析也制定了一套評(píng)分系統(tǒng)，以ELISA HIV Ag／Ab試劑為例，主要包括以下幾方面：①實(shí)驗(yàn)中需操作者準(zhǔn)備的試劑、酶標(biāo)板條、底物、洗液、酶標(biāo)抗原、稀釋血清，不需準(zhǔn)備為1分，需準(zhǔn)備為0分；②試劑盒中組分開(kāi)封或稀釋后的穩(wěn)定性，標(biāo)明開(kāi)封或稀釋后有效期的為1分，開(kāi)封或稀釋后不穩(wěn)定的為0分，試劑盒中的每一組分作為一項(xiàng)，如酶標(biāo)版條、樣品稀釋液、陰陽(yáng)性對(duì)照等；③試劑盒未提供但檢測(cè)中需要的設(shè)備或試劑，如加樣排槍、樣品稀釋管、終止液等，不需準(zhǔn)備為1分，需要準(zhǔn)備為0分；④操作者對(duì)試劑盒總體評(píng)價(jià)的總分；⑤總分，上述4項(xiàng)得分的綜合；⑥結(jié)論，<20分為不簡(jiǎn)便，≥20分而≤25分為簡(jiǎn)便，>25分為非常簡(jiǎn)便。

6．應(yīng)用于小實(shí)驗(yàn)室的可行性

WH0制定了一套評(píng)分系統(tǒng)來(lái)評(píng)價(jià)試劑是否適用于小實(shí)驗(yàn)室，主要包括以下幾方面：①敏感性，100％為5分，98％～100％為3分，<98%為0分；②特異性，>98％為5分，95％～98％為3分，<95％為O分；③反應(yīng)溫度，室溫反應(yīng)為3分，非室溫反應(yīng)為1分；④效期，>1年為5分，6個(gè)月～1年為2分，<6個(gè)月為1分；⑤每人份價(jià)格，≤1美元為3分，>1美元而≤2美元為2分，>2美元為1分；⑥操作簡(jiǎn)便性，非常簡(jiǎn)便為5分，簡(jiǎn)便為3分，不簡(jiǎn)便為1分；⑦檢測(cè)每人份的操作時(shí)間，<10min為3分，10～30min為2分，>30min為1分；⑧是否需要洗板機(jī)或攪拌器，不需要為3分，需要為1分；⑨結(jié)果判定，若為肉眼讀?。航Y(jié)果判定變異度≤3％為5分，結(jié)果判定變異度>3％為3分，若為機(jī)器讀取為1分；⑩總分，為以上9項(xiàng)得分之和；⑩結(jié)論，得分<23為不適用，得分≥23而≤30為適用，得分>30為非常適用。

7．陽(yáng)轉(zhuǎn)系列血清檢測(cè)結(jié)果

將每種待評(píng)價(jià)試劑對(duì)每個(gè)血清盤中的每一份系列血清檢測(cè)結(jié)果列于表中，同時(shí)表中列出參比試劑檢測(cè)結(jié)果，將兩結(jié)果做比較，計(jì)算出陽(yáng)轉(zhuǎn)血清相對(duì)敏感性系數(shù)(詳見(jiàn)453頁(yè))，并計(jì)算每一試劑檢測(cè)所有系列血清所得的相對(duì)敏感性系數(shù)均值和95％可信限。

8．HIV-1 O型血清盤檢測(cè)結(jié)果

若待評(píng)價(jià)試劑能檢出HIV-l O型樣品，可用HIV-1 O型血清盤對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，將檢測(cè)結(jié)果及確證試劑檢測(cè)結(jié)果作對(duì)比，來(lái)評(píng)價(jià)試劑對(duì)HIV-1 O型樣品的檢測(cè)能力。

9．操作血清盤檢測(cè)結(jié)果

對(duì)于HIV-1 Ag／Ab檢測(cè)試劑，還需用由不同滴度抗原和抗體血清組成的操作血清盤對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，將檢測(cè)結(jié)果與BBI提供的結(jié)果做比較，來(lái)評(píng)價(jià)試劑對(duì)不同滴度樣品的檢測(cè)能力。

近年來(lái)，隨著對(duì)HIV研究的不斷深入和實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)不斷發(fā)展，HIV診斷試劑研究工作取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，大量新技術(shù)、新試劑不斷涌現(xiàn)。WHO對(duì)商品化診斷試劑的評(píng)價(jià)，不僅提供了許多常規(guī)評(píng)價(jià)指標(biāo)，如敏感度、特異性等，還對(duì)試劑操作簡(jiǎn)便性、應(yīng)用于小實(shí)驗(yàn)室的可行性等進(jìn)行了評(píng)估，為醫(yī)療衛(wèi)生部門選擇試劑提供了依據(jù)，也為診斷試劑的評(píng)價(jià)提供了很好的參考。