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ELISA試劑盒教你蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法
點(diǎn)擊次數(shù):753 更新時(shí)間:2014-10-13

本實(shí)驗(yàn)的目的是學(xué)會(huì)各種蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法。了解各種測(cè)定方法的基本原理和優(yōu)缺點(diǎn)。
    目前常用的有四種古老的經(jīng)典方法,即定氮法,雙縮尿法(Biuret法)、Folin-酚試劑法(Lowry法)和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來的新的測(cè)定法,即考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法靈敏度zui高,比紫外吸收法靈敏10~20倍,比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復(fù)雜,但較準(zhǔn)確,往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。
值得注意的是,這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì),因?yàn)橐环N蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測(cè)定,有可能得出四種不同的結(jié)果。每種測(cè)定法都不是無缺的,都有其優(yōu)缺點(diǎn)。在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮:①實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和度;②蛋白質(zhì)的性質(zhì);③溶液中存在的干擾物質(zhì);④測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間。
考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法),由于其突出的優(yōu)點(diǎn),正得到越來越廣泛的應(yīng)用。
一、微量凱氏(Kjeldahl)定氮法
樣品與濃硫 酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨(消化),氨又與硫 酸作用,變成硫 酸氨。

二、雙縮脲法(Biuret法)
(一)實(shí)驗(yàn)原理
雙縮脲(NH3CONHCONH3)是兩 個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱,放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物,稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵,或能過一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵,這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。

操作方法:
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定:取12支試管分兩組,分別加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液,用水補(bǔ)足到1毫升,然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后,在室溫(20~25℃)下放置30分鐘,于540nm處進(jìn)行比色測(cè)定。用未加蛋白質(zhì)溶液的*支試管作為空白對(duì)照液。取兩組測(cè)定的平均值,以蛋白質(zhì)的含量為橫座標(biāo),光吸收值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、樣品的測(cè)定:取2~3個(gè)試管,用上述同樣的方法,測(cè)定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。

聯(lián)系人:王經(jīng)理
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