細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。

elisa試劑盒材料：凍存管，離心管，細(xì)胞培養(yǎng)用材料，500 mL燒杯，膠布，搪瓷杯，75％酒精棉。

藥品：培養(yǎng)基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清，0．25％胰蛋白酶溶液，二甲基亞砜(DMSO)或甘油，0．5％臺盼藍(lán)染液，液氮。

儀器：4℃冰箱，-70℃冰箱，液氮容器，微量加樣器，水浴鍋，離心機。

(一)細(xì)胞凍存

1．取待凍存的細(xì)胞用胰酶消化(見相關(guān)實驗細(xì)胞傳代培養(yǎng)部分)，用培養(yǎng)基將細(xì)胞沖洗下來。800r/min離心5 min，棄上清收集細(xì)胞。如果是懸浮生長的細(xì)胞，則可直接離心收集細(xì)胞。

2．加入適量凍存液(10％甘油+90％培養(yǎng)基，或者10％DMSO+90％培養(yǎng)基)制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞濃度宜大，3×106個／mL左右，并可適量增加牛血清濃度至20％。

3．細(xì)胞懸液裝入凍存管中。用膠布封裹，做好標(biāo)記(寫上細(xì)胞種類、時間及凍存條件等)。

4．凍存管在4℃下存放30 min，轉(zhuǎn)放-20℃ 1.5～2 h，再轉(zhuǎn)人-70℃ 4-12 h后即可轉(zhuǎn)移到液氮內(nèi)(-196℃)，注意進(jìn)行登記。

(二)細(xì)胞復(fù)蘇

1．取一搪瓷杯盛上適量自來水加熱至40℃左右。

2．從液氮中取出凍存管立即投人40℃水中迅速解凍。

3．取出凍存管，用75％酒精清潔管口，打開。

4．離心去上清收集細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基洗1次，加人3 mL新鮮培養(yǎng)基，于小培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

5．每日觀察細(xì)胞生長情況，如果死細(xì)胞較多，復(fù)蘇次日應(yīng)換液。待細(xì)胞長滿后可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。elisa試劑盒