凍存的步驟：
1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細胞生長情形。
2. 使用ScienCell凍存液 混合均勻，置于室溫下待用。
3. 依細胞傳代培養(yǎng)的操作，收集培養(yǎng)好的細胞，取少量細胞懸浮液(約0.1 ml) 計數(shù)細胞濃度及凍前存活率。
4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1-5 x 10^6 cells/ml，混合均勻，
分裝于已標示*之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。
5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4 度10 分鐘→ -20 度 30 分鐘→ -80 度16～18 小時(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 長期儲存。
6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設定程序之等速降溫機中，再放入液氮槽中。程序為: program 7: HB CELL 。

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產(chǎn)品特點:
1、 使用方便:不需昂貴設備。
2、 可以處理各種細菌菌體，包括新鮮菌液和冰凍菌體。
3、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時。
4、 采用溫和的中性裂解組分，保持蛋白活性。
5、 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。
6、 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。
7、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等。
8、 本試劑盒中不有EDTA，與金屬螯和層析等兼容。
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細胞培養(yǎng)技巧：
一、凍存時的注意事項：
1. 在冷凍保存之前，應觀察細胞生長是否良好(log phase) 且存活率高，凍存的細胞密度為80 – 90 ％
2. 冷凍前檢測細胞是否保有其*性質，例如是否有雜細胞或者支原體等。
3. 使用的DMSO 應為試劑級等級，以5~10 ml 小體積分裝，4 度避光保存，勿作多次解凍。使用的甘油也應為試劑級等級，以高壓蒸汽
滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。
4. 冷凍保存的細胞濃度：
4-1. 正常的成纖維細胞: 1-3x 10^6 cells/ml
4-2 雜交瘤細胞: 1~3 x 10^6 cells/ml，細胞濃度不要太高，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后。
4-3.貼壁腫瘤細胞: 1 x 10^6，依細胞種類而異。腺癌類的細胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml。
4-4. 懸浮細胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細胞須至少5 x 10^6 cells/ml。
5. 冷凍保護劑濃度為5 %或10 ％ DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。 
培養(yǎng)操作步驟 ：
1．用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布； 
2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）； 
3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時； 
4．將經(jīng)過計數(shù)的細胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中； 
5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當貼壁細胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學檢測。 
實驗報告：
一、分離與培養(yǎng)：
1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；
2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；
3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；
4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；
二、免疫熒光鑒定：
1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；
2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；
4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；
5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；
6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

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A875(人黑色素瘤細胞)說明書D/E (Dey/Engley) Neutralizing Broth    

Mannitol Salt Agar    

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