操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測(cè)每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

中文名稱：GSK-3β抑制劑(CP21R7)

英文名稱：CP21R7

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg

產(chǎn)品貨號(hào)：BJ-01X7836

細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

澤瀉醇A

英文別名：   Dammar-13(17)-en-3-one, 11, 23, 24, 25-tetrahydroxy-, (8α,9β,11,β 14β, 23S, 24R)-

CAS登錄號(hào)：   19885-10-0

分子式：   C30H50O5

分子量：   490.70

(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷

英文別名：   Pinoresinol 4-O-glucoside

CAS登錄號(hào)：   69251-96-3

分子式：   C26H32O11

分子量：   520.53

澤瀉醇A-24-醋酸酯

英文名：   Alisol A 24-acetate

英文別名：   (8alpha,9beta,11beta,14beta,23S,24R)-24-(Acetyloxy)-11,23,25-trihydroxydammar-13(17)-en-3-one

CAS登錄號(hào)：   18674-16-3

分子式：   C32H52O6

野漆樹苷

英文名：   Rhoifolin

英文別名：   APIGENIN-7-NEOHESPERIDOSIDE

CAS登錄號(hào)：   17306-46-6

分子式：   C27H30O14

雞屎藤苷酸甲酯

英文別名：   Methyl paederosidate

CAS登錄號(hào)：   122413-01-8

分子式：   C19H26O12S

分子量：   478.47

雞屎藤苷酸

CAS登錄號(hào)：   18842-98-3

分子式：   C18H24O12S

分子量：   464.45

分子結(jié)構(gòu)：     

雞屎藤苷

CAS登錄號(hào)：   20547-45-9

分子式：   C18H22O11S

分子量：   446.43

分子結(jié)構(gòu)：     

三七皂苷R2(S型)

英文名：   20(S)-NotoginsenosideR2

英文別名：   Ginsenoside Ng-R2

CAS登錄號(hào)：   80418-25-3

分子式：   C41H70O13

異夏佛塔苷

英文名：   Isoshaftoside

英文別名：   apigenin-6-α-L-arabinosyl-8-β-glucoside

CAS登錄號(hào)：   52012-29-0

分子式：   C26H28O14

白皮杉醇

英文名：   Piceatannol

英文別名：   (E)-4-[2-(3,5Dihydroxyphenyl)ethenyl]1,2-benzenediol;3,3',4,5'-Tetrahydroxy-trans-stilbene

CAS登錄號(hào)：   10083-24-6

分子式：   C14H12O4

馬兜鈴酸A

英文名：   Aristolochic Acid A

英文別名：   3,4-methylenedioxy-8-methoxy-10-nitro-1-phenanthrenecarboxylicacid

CAS登錄號(hào)：   313-67-7

分子式：   C17H11NO7

GSK-3β抑制劑(CP21R7)臺(tái)盼藍(lán)染色液(0.4%)  20ml  0.4% Typan Blue Solution25g 丙酮酸鈉 Pyruvic Acid Sodium Salt -20℃保存

臺(tái)盼藍(lán)染色法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒  100T  Typan Blue Staining Cell Viability Assay Kit50T 鼠疫桿菌PCR檢測(cè)試劑盒   低溫運(yùn)輸，-20℃保存

細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒III(FITC)  20T  1 g PDTC （NF-κB抑制劑/抗氧化劑） Cell Apoptosis Inducer and Inhibitor -20℃保存

細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒IV(CY3)  20T/100T  250mL Galactose Solution（半乳糖溶液）,20%（W/V） Galactose Solution,20%（W/V） 常溫保存

細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒IV(FITC+POD)  20T  5次 DAB法辛雜交試劑盒  

細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒V(POD)  100T  2 ug Piz/v5-His Piz/v5-His 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Ⅱ(AP)  20T  OADC添加劑  10ml*10支

臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率檢測(cè)試劑盒  100T  1瓶 LTEP-a-2細(xì)胞株 LTEP-a-2 低溫運(yùn)輸和保存

JC-1線粒體膜電位熒光探針  1mg|5mg  CVT瓊脂 CVT Agar 250g

CCCP細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑(50mM)  100ul  Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone100g 丙烯酰胺 Acrylamide 密封陰涼保存

DAPI溶液(即用型)  10ml|50mL  DAPI solution(ready-to-use)1000mL TAE,10X   TAE,10X   常溫保存