培養(yǎng)操作步驟 ：

1．用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。 

產(chǎn)品參數(shù)：

商品詳細(xì)介紹：

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明：

1．本方法適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，而不適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞可使用滴片法；

2．所使用的蓋玻片應(yīng)該為優(yōu)質(zhì)玻璃，并經(jīng)過鉻酸洗液處理；

3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時(shí)動(dòng)作要輕；

4．如果需要更多生長狀態(tài)一致的細(xì)胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿，但不宜過大，以避免培養(yǎng)液的浪費(fèi)和增加污染機(jī)率；

5．如果細(xì)胞貼壁生長能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。

操作要點(diǎn)：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個(gè)15mL無菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。

2）將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動(dòng)凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)*解凍，使細(xì)胞能盡快通過最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細(xì)胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液。

5）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶內(nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6）第二天觀察細(xì)胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

人 AGPAT3 基因全長ORF克隆小鼠Ⅲ型前膠原肽(PⅢP)免疫試劑盒*直銷

人 FBLIM1 基因全長ORF克隆小鼠Ⅲ型前膠原氨基端肽(PⅢNT)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 HSD3B2 基因全長ORF克隆小鼠Ⅲ型前膠原(HPCⅢ)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 ACOT7 基因全長ORF克隆小鼠Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 OPRL1 基因全長ORF克隆小鼠3-硝基酪(3-NT)免疫試劑盒*直銷

人 DRG1 基因全長ORF克隆小鼠3-α羥基類固醇脫氫(Akr1c9)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 ACTL8 基因全長ORF克隆小鼠3-O-(3-OMD)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 SH3GLB1 基因全長ORF克隆小鼠Ⅱ型膠原螺旋肽(HELIX-Ⅱ)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 SGMS2 基因全長ORF克隆小鼠Ⅱ型膠原C端肽(CTX-Ⅱ)免疫試劑盒*直銷

人 ADA 基因全長ORF克隆小鼠Ⅱ型膠原(Col Ⅱ)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 HEXIM1 基因全長ORF克隆小鼠25羥基D3(25 HVD3)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

EGFR突變體抑制劑(Naquotinib mesylate)PI3Kδ抑制劑(AMG319)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  AMG3191瓶 A2細(xì)胞株 A2 低溫運(yùn)輸和保存

CDK8抑制劑(MSC2530818)  1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg  MSC25308181臺(tái) 分子雜交爐 Hybridization Oven 常溫

BRPF1B和BRPF2bromodomain抑制劑（OF-1）  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg  OF-1100次 總抗氧化能力檢測試劑盒（FRAP法） Oxidative Stress Detection Kit 常溫保存

Tankyrase抑制劑（G007-LK）  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  G007-LKDNA甲基綠瓊脂基礎(chǔ) Dnase Agar Base with Methyl Green 100

EGFR抑制劑(BIBX 1382)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg  BIBX 1382100次 真菌種屬鑒定 PCR Mix 5（RPB1） Fungal DNA Barcoding PCR Mix -20℃保存

ATPase VCP/p97抑制劑（NMS-859）  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  NMS-8592 ug pALEX b pALEX b 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

PARP抑制劑(INO-1001)  1mL(10mM)|200mg|500mg  INO-1001氧化胺培養(yǎng)基 TMAO Medium 250g

JAK2抑制劑（BMS-911543）  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  BMS-9115431瓶 Saos-2細(xì)胞株 Saos-2 低溫運(yùn)輸和保存

EGFR和ErbB2抑制劑(AST-1306 TsOH)  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg  AST-1306 TsOH胰蛋白胨大豆肉湯  250g

Trk抑制劑(GNF-5837)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg|200mg  GNF-58371g 二乙酸熒光素 Fluorescein Diacetate -20℃避光保存

PKC抑制劑(Verbascoside)  1mL(10mM)|10mg|50mg|100mg  Verbascoside50T 創(chuàng)傷弧菌PCR檢測試劑盒  低溫運(yùn)輸，-20℃保存