操作規(guī)程 1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時. 2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。 3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。 4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。 5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。 6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。 7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。 8、結果分析 a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100 b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90) 中文名稱：Ad-GFP-LC3B 英文名稱：Adenovirus expressing GFP-LC3B fusion protein 產(chǎn)品規(guī)格：1ml|10×1ml 產(chǎn)品貨號：BJ-01X6347 本品是一種可以表達GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒，可以用于感染細胞或組織后進行細胞自噬(autophagy)的檢測。 LC3是酵母自噬關鍵蛋白ATG8在哺乳動物中的同源蛋白。LC3初被分析鑒定為microtubule-associated protein 1 light chain 3 。LC3蛋白家族包括LC3A、B、C和GABARAP等亞家族，其中對于LC3B的研究為廣泛。到目前為止，LC3B被認為是細胞自噬信號通路為關鍵的標志性蛋白。LC3B是一個具有125個氨基酸殘基的蛋白，在蛋白合成后，被Atg4所酶切而失去了C端的22個氨基酸蛋白，從而暴露出C端的甘，人們把它命名為胞質(zhì)形式的LC3B I。在細胞自噬的過程中，其C端暴露的甘經(jīng)過一個類似泛素化的過程，以ATG7為E1樣激活酶， 以ATG3為E2樣連接酶，以Atg12-Atg5-Atg16復合物為E3樣連接酶，在C端甘上共價連接上磷脂酰而成為LC3B-PE即LC3B II。與胞質(zhì)定位的LC3B I不同，LC3B II定位于自噬體的內(nèi)膜和外膜上。在自噬體與溶酶體融合后，自噬體外膜上的LC3B II被Atg4所酶切，而自噬體內(nèi)膜上的LC3B II則被溶酶體內(nèi)的蛋白酶所降解。盡管LC3B II比LC3B I的分子量要大，但由于其強的疏水性，在SDS-PAGE電泳時，LC3B II比LC3B I遷移得更快，其表觀分子量分別為14kD和16kD。在用GFP-LC3B腺病毒感染細胞后，在非自噬的情況下，熒光顯微鏡下GFP-LC3B以彌散的形式存在于細胞質(zhì)中；而在自噬的情況下，熒光顯微鏡下GFP-LC3B則聚集在自噬體膜上，以斑點的形式表現(xiàn)出來。 自噬是一種在進化上高度保守的通過溶酶體吞噬并降解部分自身組分的細胞內(nèi)分解代謝途徑。自噬與多種生理功能有關，在饑餓等不利的環(huán)境條件下， 細胞通過自噬降解多余或異常的細胞內(nèi)組分，為細胞的生存提供能量及原材料，促進生物體的生長發(fā)育、細胞分化及對環(huán)境變化產(chǎn)生應答。自噬異常與多種病理過程如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、代謝疾病、病原體感染等都有密切關系。由于細胞自噬在生理和病理過程中都有重要作用，自噬已經(jīng)成為細胞生物學領域的一個新的研究熱點。 Ad-GFP-LC3B是的重組腺病毒，感染后能夠在靶細胞中有效表達綠色熒光蛋白(GFP)和LC3B的融合蛋白，呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，可以用于細胞自噬的檢測。 腺病毒感染細胞后為瞬時表達，通常不會與基因組DNA重組，不能用于篩選穩(wěn)定細胞株。本產(chǎn)品感染體內(nèi)外細胞后，有效表達時間通常不少于7天，不同細胞和組織的有效表達時間有所不同。感染10-14天后融合蛋白的表達很可能會大大減弱。 Ad-GFP-LC3B采用了成熟的E1缺陷型重組腺病毒載體系統(tǒng)，感染普通的細胞后不能進行擴增和重組，從而可以有效降低本產(chǎn)品在活體生物中的風險。 本產(chǎn)品可以在表達E1的HEK293A、HEK293等適當細胞中擴增。 本產(chǎn)品的滴度≥1×108 pfu/ml，使用時可以按照108pfu/ml進行計算。如果按照20 MOI感染6孔板的細胞，每孔50萬細胞計算，共可以感染10個孔；如果按照20 MOI感染24孔板的細胞，每孔10萬細胞計算，共可以感染50個孔。如果MOI值提高，則相應可以感染的孔數(shù)會減少；如果MOI值降低，則相應可以感染的孔數(shù)會增加。 儲存條件：-20℃，有效期1～2個月。 |
細胞培養(yǎng)操作規(guī)程： 一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備： 1） 準備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。 2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。 3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。 二． 細胞處理： 1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。 2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
細胞培養(yǎng)方法： 1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代 ①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次； ②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化； ③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止； ④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清； ⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基； ⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。 2、細胞復蘇： ①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。 ②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。 3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種 ①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶） ②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化； ③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞； ④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。 Theileria spp.泰勒屬原蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Avian Infectious Bronchitis Virus(AIBV)禽傳染性支氣管炎病毒通用RT-LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Seneca Valley virus(SVV)塞內(nèi)加谷病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Microsporum nanum納米小孢子LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 動物源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒 種源性檢測/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Human Coronavirus(HCoV-OC43)人OC43染料法熒光定量RT-PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Human Parainfluenza Virus 1(HPIV-1)人副流感病毒1型探針法熒光定量RT-PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Herpes Simplex Virus(HSV)單純皰疹病毒通用LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Avian Mycoplasma spp.禽類支原體通用LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Herba lysimachiae金錢草PCR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 Helicobacter pullorum幼禽螺桿探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 蛇源性成分PCR檢測試劑盒 種源性檢測/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Ad-GFP-LC3B明膠法大鼠胚胎干細胞繁殖試劑盒 10次 定量PCR擴增檢測試劑盒 定量PCR擴增檢測試劑盒 細胞CYTOCHROME C蛋白表達熒光定量檢測試劑盒 10/50 次 體液VZV（VARICELLA ZOSTER）病毒定量PCR擴增檢測試劑盒 20次 *氨基酸補充溶液（1X） 100毫升 體液基質(zhì)金屬蛋白抑制劑2（TIMP-2）活性比色法定量檢測試劑盒 20次 石蠟切片組織P16蛋白表達NBT顯色光學顯微鏡檢測試劑盒 10/20次 組織AX1激活性定量檢測試劑盒（A/B/C） 20次 無菌采樣袋（12cm*18cm）（帶壓條） 英文名稱：Aseptic Sampling Bag 產(chǎn)品規(guī)格：100個/包 酵母化學感受態(tài)細胞直接轉(zhuǎn)化試劑盒 20次
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