細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

中文名稱：PDK1抑制劑（PDK1 inhibitor）

英文名稱：PDK1 inhibitor

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg

產(chǎn)品貨號(hào)：BJ-01X7987

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

人 STOM 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子胰島素(INS)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 NRBF2 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子氧化低密度脂蛋白(OxLDL)免疫試劑盒*直銷

人 ROGDI 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子血小板因子4(PF-4/CXCL4)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 HAAO 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子血小板衍生生長(zhǎng)因子AB(PDGF-AB)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 EAPP 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子血小板衍生生長(zhǎng)因子AA(PDGF-AA)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 FHL5 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子血小板活化因子(PAF)免疫試劑盒*直銷

人 ERMN 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子血纖蛋白原降解產(chǎn)物(FDP)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 AP5M1 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 SIX1 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子血管緊張素1-7(Ang1-7)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 TPM1 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子心肌肌鈣蛋白T(cTn-T)免疫試劑盒*直銷

人 MAPRE3 基因全長(zhǎng)ORF克隆兔子線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ 免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

PDK1抑制劑（PDK1 inhibitor）微管蛋白抑制劑(Mc-MMAE)  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg  Mc-MMAE2 ug pGBK-53 pGBK-53 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

Mer/Flt3雙重激酶抑制劑（UNC2025 hydrochloride）  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  UNC2025 hydrochloride100mL Tricine Buffer,0.5M,pH8.5  Tricine Buffer,0.5M,pH8.5  常溫保存

I型HDAC抑制劑（4SC-202 free base）  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  4SC-202 free base50mL 肝素瓊脂糖 Heparin Agarose  4℃保存

PARP抑制劑(BMN-673 8R,9S)  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg|200mg  BMN-673 8R,9S2 ug pUB6/V5 His C pUB6/V5 His C 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

CDK抑制劑（RGB-286638 free base）  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  RGB-286638 free base100mL 非凍型組織DNA保存液 Tissue DNALOCKER 室溫

EGFR突變體抑制劑(CNX-2006)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  CNX-20062 ug pDK46 pDK46 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

PI4KIIIβ抑制劑（PI4KIII beta inhibitor 3）  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg  PI4KIII beta inhibitor 3WILKINS-CHALGREN瓊脂 WILKINS-CHALGREN Agar 250g

FAK和Pyk2kinase抑制劑（PF-562271 besylate）  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  PF-562271 besylate100mL 交聯(lián)瓊脂糖凝膠 4B Sepharose CL-4B 4-8℃保存

VEGFR2抑制劑(Ki8751)  1mL(10mM)|10mg|50mg|100mg  Ki875150T 新城疫病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒  低溫運(yùn)輸，-20℃保存

mTOR抑制劑(XL388)  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  XL3882 ug pYr-1.1-hU6-EGFP（可包裝腺病毒） pYr-1.1-hU6-EGFP（可包裝腺病毒） 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

多靶點(diǎn)激酶抑制劑（Altiratinib）  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  AltiratinibMEM維持液 MEM maintenance of fluid 36支/盒